一、总则

第一条【制定目的】

为规范病理科免疫病理（免疫组织化学及原位杂交，以下简称免疫病理）技术操作流程，提高检测结果的准确性、重复性和可靠性，为临床病理诊断提供科学依据，保障医疗质量与患者安全，特制定本规范。

第二条【制定依据】

本规范依据《中华人民共和国执业医师法》《医疗机构管理条例》《临床病理科建设与管理指南（试行）》《ISO 15189医学实验室质量和能力认可准则》以及国家卫生健康委员会发布的相关病理技术操作标准，结合本院实际情况制定。

第三条【适用范围】

本规范适用于本院病理科所有从事免疫病理技术操作的人员、管理人员及审核人员。涵盖所有人体组织标本、细胞学标本的免疫病理检测活动。

第四条【基本原则】

免疫病理技术操作应遵循以下原则：

·质量第一原则：始终将检测质量放在首位，确保每一张切片的真实性和准确性。

·标准化原则：所有操作步骤必须严格按照标准化作业程序（SOP）执行，减少人为误差。

·对照原则：每次实验必须设置阳性对照、阴性对照及内部对照，以监控实验的有效性。

·安全原则：严格遵守生物安全管理规定，做好个人防护及废弃物处理，防止职业暴露及环境污染。

第五条【术语定义】

·免疫组织化学（IHC）：利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记在抗体上的显色剂（如酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对含量的技术。

·原位杂交（ISH）：用带有标记的核酸探针与组织细胞中特定的核酸序列进行杂交，通过显色反应或荧光信号检测，对目标DNA或RNA进行定位、定性及定量分析的技术。

·抗原修复：通过物理或化学方法，破坏甲醛固定产生的亚甲基桥，逆转抗原被掩盖的过程，恢复抗原的免疫反应性。

二、组织管理与人员职责

第六条【组织架构】

病理科实行科主任负责制，下设技术组、诊断组及质量管理组。免疫病理室隶属于技术组，在科主任及技术组长的领导下开展工作。

第七条【人员资质要求】

从事免疫病理技术操作的人员必须具备以下条件：

·具有病理学、医学检验技术或相关专业背景。

·取得相应的卫生专业技术资格证书及执业证书。

·接受过免疫病理专业技术培训并考核合格，具备独立操作能力。

·定期参加继续医学教育和专业技能培训。

第八条【岗位职责】

·技术主管：负责免疫病理实验室的全面管理，制定SOP，审核试剂耗材采购计划，监控室内质控及室间质评，处理技术疑难问题。

·技术员：负责标本的接收、处理、切片、染色、封片等具体操作，做好仪器维护保养，填写相关记录。

·复核人员：负责对染色结果进行初步评估，检查对照设置情况及染色质量，确认合格后送交病理医师诊断。

·病理医师：负责提出免疫组化检测申请，判读染色结果，发出诊断报告，并对检测结果的临床相关性进行评价。

三、实验室环境与设施设备

第九条【环境要求】

免疫病理实验室应划分明确的功能区域，包括：

·标本准备区：用于标本接收、取材和固定。

·切片制作区：用于包埋、切片和烤片。

·染色实验区：用于脱蜡、水化、抗原修复及免疫染色。该区域应保持良好的通风，配备排风设施。

·显微镜观察区：用于阅片和结果记录。

·试剂储存区：用于抗体、检测试剂及危险化学品的储存，需配备冰箱及监控设备。

各区域应保持清洁、整齐，温湿度适宜（温度18-25℃，相对湿度30%-60%），定期进行紫外线消毒及环境卫生学监测。

第十条【仪器设备配置】

实验室应配备以下主要仪器设备，并建立设备档案：

·全自动组织脱水机

·石蜡包埋机

·石蜡切片机（及摊烤片机）

·全自动免疫组化染色机（或手工染色设备）

·显微镜（配备明场、荧光功能，具备照相系统）

·高压锅或微波炉（用于抗原修复）

·恒温培养箱

·冰箱（4℃、-20℃及超低温冰箱）

·移液器及精密天平

第十一条【设备维护与校准】

·建立仪器设备操作规程、维护保养规程及校准规程。

·每日工作前检查仪器运行状态，工作后进行清洁保养。

·定期对关键设备（如切片机、染色机、移液器、温度计）进行校准和性能验证，并记录存档。

·设备出现故障时应立即停用，悬挂“故障”标识，及时报修并启用备用方案。

四、试剂与耗材管理

第十二条【试剂采购与验收】

·试剂采购应由科室提出申请，经医院相关部门审核批准后，从具有合法资质的供应商处采购。

·新购试剂入库时，应由专人负责验收，核对产品名称、规格、批号、有效期、生产单位、注册证号等信息，确认包装完好、冷链运输符合要求后，方可入库登记。

第十三条条【抗体管理】

抗体是免疫病理检测的核心试剂，应重点管理：

·储存：严格按照说明书要求储存。浓缩抗体通常分装后于-20℃以下保存（避免反复冻融），即用型抗体于2-8℃保存。

·效价测试：新购进或更换批号的浓缩抗体，在使用前必须进行效价测试（滴度曲线），确定最佳工作浓度。

·记录：建立抗体台账，记录抗体的克隆号、来源、种属、批号、效价、有效期、储存条件及启用日期。

第十四条【检测试剂管理】

检测试剂包括封闭血清、二抗、显色剂（如DAB）、底物缓冲液等：

·显色剂（如DAB）具有致癌性，应双人双锁管理，领用登记。

·试剂盒应严格按照说明书保存和使用，不同批号试剂盒不得混用。

·配制好的工作液应标注名称、浓度、配制日期及有效期，置于2-8℃保存，定期检查是否变质。

第十五条【质量控制试剂】

实验室应储备充足的质控品，包括：

·阳性对照组织：已知表达目标抗原的组织，用于监控染色系统的敏感性。

·阴性对照组织：已知不表达目标抗原的组织，用于监控染色系统的特异性。

·多组织芯片（TMA）：包含多种正常及肿瘤组织，用于高通量质量监控。

五、标本接收与前处理

第十六条【标本接收】

接收免疫组化检测申请时，应核对以下信息：

·病理号、患者姓名、性别、年龄、床号/住院号。

·申请检测的项目、抗体名称。

·原有常规HE切片的病理诊断结果，确保检测目的明确。

·白片或蜡块的数量及完整性。 对于信息不符或标本不合格的申请，应及时与临床医师或取材医师联系，拒收并记录原因。

第十七条【固定要求】

组织标本的固定是免疫组化成功的关键：

·固定液：首选10%中性缓冲福尔马林（NBF），避免使用酸性固定液（如Bouin液、Zenker液）。

·固定时间：组织离体后应尽快固定，固定液体积应为组织体积的5-10倍。一般组织固定6-24小时为宜，固定时间过短会导致抗原丢失，过长会导致抗原遮蔽。

·穿刺及小标本：固定时间控制在6-12小时。

第十八条【切片制备】

用于免疫组化染色的切片应符合以下标准：

·切片厚度：一般为3-4μm。过厚会导致背景深、细胞重叠；过薄会导致抗原量不足。

·载玻片：必须使用防脱片载玻片（经多聚赖氨酸或APES处理）。

·烤片：切片置60-65℃烤箱烘烤1-2小时，或60℃过夜，以确组织紧密贴附在玻片上并熔化石蜡。

·切片保存：若不立即染色，切片应密封干燥避光保存（4℃或-20℃），以防止抗原衰减。

六、免疫组化染色操作流程

第十九条【操作模式】

免疫组化染色可采用全自动染色机或手工操作。无论采用何种方式，必须严格遵守标准操作流程。

第二十条【手工染色基本流程】

·1. 脱蜡和水化

o切片入二甲苯Ⅰ 10分钟

o切片入二甲苯Ⅱ 10分钟

o100%乙醇Ⅰ 3分钟

o100%乙醇Ⅱ 3分钟

o95%乙醇 3分钟

o80%乙醇 3分钟

o蒸馏水洗 3分钟（或PBS洗）

·2. 抗原修复

o根据抗体说明书选择修复方法（热修复或酶修复）。

o热修复：常用高压锅法或微波法。

§将切片置于抗原修复缓冲液（如柠檬酸盐pH6.0或EDTA pH9.0）中。

§高压锅加热至喷气后计时1.5-2分钟，或微波炉中高火加热至沸腾后调低火维持10-15分钟。

§自然冷却至室温（此步骤至关重要，不可强行冷却）。

§PBS冲洗3次，每次3分钟。

o酶修复：主要用于细胞间质抗原（如胶原、层粘连蛋白），常用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，时间需严格控制。

·3. 阻断内源性过氧化物酶及非特异性染色

o切片滴加3%过氧化氢（或甲醇双氧水），室温孵育10-15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。

oPBS冲洗3次，每次3分钟。

o（可选）滴加正常非免疫动物血清（如10%山羊血清），室温孵育10-20分钟，以封闭非特异性结合位点。倾去血清（勿洗）。

·4. 一抗孵育

o滴加适当稀释度的一抗（需根据预实验确定的最佳浓度）。

o置湿盒内，37℃孵育30-60分钟，或4℃过夜（过夜更佳）。

oPBS冲洗3次，每次5分钟（可使用PBS-T增加去污效果）。

·5. 二抗/聚合物孵育

o滴加生物素标记的二抗（或HRP标记的抗抗体聚合物）。

o置湿盒内，37℃孵育20-30分钟。

oPBS冲洗3次，每次5分钟。

o（若使用ABC法或SP法，需在此步骤前或后滴加酶标亲和素/聚合物复合物，并冲洗）。

·6. 显色反应

o准备显色剂（如DAB显色液），现配现用，避光保存。

o在显微镜下控制显色时间，滴加显色剂后观察显色强度。

o阳性部位呈现棕黄色（DAB）或特定颜色时，立即用蒸馏水终止反应。

o显色时间通常为3-10分钟，避免显色过度导致背景过深。

·7. 复染与封片

o苏木素复染细胞核30秒-1分钟。

o自来水冲洗返蓝。

o梯度酒精脱水（80%-95%-100%）。

o二甲苯透明。

o中性树胶封片。

第二十一条条【全自动染色机操作】

·开机预热，确保液路及加样针通畅。

·按照仪器软件界面设置程序，输入脱蜡、修复、一抗、二抗、显色等步骤的参数。

·正确装载切片、试剂及废液桶。

·运行程序，运行过程中密切监控仪器状态，防止卡片、漏液。

·运行结束后取出切片，进行复染、脱水、封片。

七、原位杂交操作流程

第二十二条【基本原理】

原位杂交包括荧光原位杂交（FISH）和显色原位杂交（CISH）。本规范重点阐述显色原位杂交操作流程。

第二十三条条【操作步骤】

·1. 切片预处理

o切片厚度3-4μm，烤片过夜。

o二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。

oDEPC水处理（防止RNA酶降解）。

·2. 酶消化暴露靶核酸

o滴加胃蛋白酶或蛋白酶K溶液，37℃消化10-20分钟（时间需优化）。

oDEPC水或PBS冲洗。

第二十四条条【杂交过程】

·1. 预杂交

o滴加预杂交液，37-42℃孵育1小时，封闭非特异性位点。

·2. 杂交

o滴加含探针的杂交液。

o加盖硅化盖玻片，橡胶封边胶密封。

o置湿盒中，95℃变性10-15分钟（使DNA双链解开），迅速转入37-42℃杂交过夜（16-20小时）。

第二十五条条【杂交后洗涤及检测】

·揭掉盖玻片，洗涤去除未结合探针（系列SSC缓冲液，不同盐浓度和温度）。

·滴加封闭液。

·滴加抗地高辛或生物素化抗体。

·滴加酶标链霉亲和素或AP/HRP标记二抗。

·滴加BCIP/NBT（AP显色）或DAB（HRP显色）。

·核固红或甲基绿复染。

·脱水、透明、封片。

八、对照设置与结果评估

第二十六条条【对照设置原则】

每次染色实验必须同时设置以下对照，且对照结果必须符合预期，否则本次实验无效：

·阳性对照：使用已知表达该抗原的组织切片，必须出现明确的阳性信号。

·阴性对照：

o替换对照：用PBS或正常血清替代一抗，结果应为阴性。

o组织对照：使用已知不表达该抗原的组织，结果应为阴性。

·内部对照：切片中自身的正常细胞成分可作为内对照（如：检测淋巴瘤时，血管内皮细胞可作为CD34的内对照）。

第二十七条条【阳性结果判断标准】

·定位：明确抗原表达的细胞部位（细胞核、细胞质、细胞膜）。

·着色强度：

o（-）：无着色或与背景一致。

o（+）：弱阳性，浅棕黄色。

o（++）：中度阳性，棕黄色。

o（+++）：强阳性，深棕黄色或棕褐色。

·阳性细胞分布范围：记录阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比（如：>10%、>25%、>50%）。

第二十八条条【质量评估标准】

技术人员在交片给医师前，必须评估切片质量：

·优质片：阳性信号定位准确、着色清晰、强度适中；无非特异性背景染色；阴性对照无着色；组织完整无脱落。

·合格片：阳性信号清晰，背景浅，不影响判读。

·不合格片：阳性信号过弱或缺失、背景过深、组织脱落、严重干片或坏死干扰。不合格切片必须重新染色。

九、常见问题分析与对策

第二十九条条【无阳性信号或信号弱】

可能原因及对策：

·抗体失效或稀释度过高：更换抗体或重新测定效价。

·抗原丢失：固定时间过长或修复不足。调整修复方法（延长修复时间或更换修复液）。

·操作步骤遗漏：检查一抗、二抗是否漏加。

·显色时间过短：延长显色时间。

第三十条条【非特异性背景染色】

可能原因及对策：

·内源性酶未阻断：延长过氧化氢孵育时间。

·抗体浓度过高：适当稀释抗体。

·孵育时间过长或温度过高：缩短孵育时间或降低温度。

·清洗不充分：增加PBS冲洗次数和时间。

·组织坏死：避开坏死区域判读或取材时剔除坏死组织。

第三十一条条【组织脱落** 可能原因及对策：

·载玻片未进行防脱处理：使用防脱片载玻片。

·烤片时间或温度不足：延长烤片时间。

·抗原修复温度剧烈变化：修复后自然冷却。

·冲洗过于剧烈：操作轻柔。

十、室内质量控制与室间质评

第三十二条条【室内质控（IQC）】

·日常质控：每日记录环境温湿度、仪器运行参数。

·染色质控：每批次染色（通常不超过20例）必须包含阳性对照和阴性对照。

·质控图：对关键试剂（如DAB显色时间、抗体效价）建立质控图，监测趋势变化。

·定期回顾：每月召开质量分析会，讨论本月出现的质量问题及改进措施。

第三十三条条【室间质评（EQA/PT）】

·积极参加国家卫生健康委临床检验中心（NCCL）或省临检中心组织的免疫组化室间质评活动。

·按照质评机构要求，在规定时间内完成检测并上报结果。

·对质评回报结果进行认真分析，如出现不合格结果，应立即查找原因，制定纠正措施，并记录整改效果。

十一、生物安全与废弃物处理

第三十四条条【个人防护】

操作人员必须穿戴个人防护装备（PPE）：

·实验操作时必须穿戴工作服、手套、口罩。

·配制显色剂（DAB）或处理致癌物时，必须佩戴防毒面具并在通风橱内操作。

·发生标本或试剂溢出时，应立即穿戴防护用品进行清理和消毒。

第三十五条条】【危险化学品管理】

·DAB（3,3’-二氨基联苯胺）为潜在致癌物，应标记明显警示。

·二甲苯、甲醛等有毒挥发性试剂应集中储存于通风良好的试剂柜中。

·建立危险化学品领用和使用登记本。

第三十六条条】【废弃物处理】

·医疗废物：废弃的组织标本、一次性手套、吸水纸等属于感染性废物，应放入黄色垃圾袋，按医疗废物处理流程处置。

·化学废物：废弃的二甲苯、甲醛、DAB溶液等属于化学性废物，应收集在专用废液桶中，交由有资质的机构回收处理，严禁直接排入下水道。

·锐器：刀片、针头等锐器应放入利器盒。

十二、附则

第三十七条条】【解释权】

本规范由医院病理科负责解释。

第三十八条条】【修订】

本规范将根据国家相关法律法规更新、技术发展及实际运行情况，定期进行评审和修订。

第三十九条条】【生效日期】

本规范自发布之日起施行。

附件：

1.免疫组化常用抗体克隆号及修复条件表

2.免疫病理试剂验收记录表

3.免疫组化染色每日质控记录表

4.不合格切片处理记录表

附件1：免疫组化常用抗体克隆号及修复条件表（示例）

附件2：免疫病理试剂验收记录表（模板）

附件3：免疫组化染色每日质控记录表（模板）

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